病毒蛋白永生化人原代树突状细胞激活CTL产生抗肿瘤性
目前制备用于癌症疫苗免疫治疗的树突状细胞（DC）的方法，大多通过复杂的过程激活的单核细胞来源的DC（MoDC）负载抗原，导致DC难以在培养中维持，生长潜力低，并且需要重复制备几轮用于疫苗递送。在最近发表在PNAS上的一篇论文中，Wu等人开发了一种永生化和组成型活化的人类原代树突状细胞系（IHV-DCs）的方法，该方法利用病毒蛋白Tax，Tax是一种来自人类T细胞白血病病毒2型（HTLV-2）的转录调节因子。
构建永生化DC细胞
首先，Wu等人用慢病毒转导Tax至受刺激的外周血单核细胞（PBMC），并在两到三周后用Anti-CD3 magnetic beads选择转导的细胞以去除T细胞。CD3阴性细胞在培养基中连续培养。构建了两种细胞系，分别名为ihv-DC1和ihv-DC2，在培养基中连续培养超过6个月，并显示出DC相关标志物（CD11c，CD141，CD205）和DC成熟和活化标志物（CD83，CD80，CD86，CD70，CCR7，HLA-DR），永生化率约为20%。为了验证Tax促进DC生长的能力，研究人员通过用GM-CSF / IL-4刺激PBMC的贴壁单核细胞并生成MoDC。呈现树突状的MoDCs通过Tax转导，在培养过程中保持增殖长达3个月，但未永生化，因为MoDC-Tax细胞已具有成熟和活化的表型，本实验验证了Tax在标准培养条件下促进DC生长的能力。
激活细胞毒性CD8 T淋巴细胞释放炎症因子
尽管各种Toll样受体（TLR）在Tax转导的DC中上调，但在这些已经持续高水平表达共刺激分子组成型激活的DC系中，它们不再是诱导成熟和激活所必需的。ihv-DC和Tax转导的MoDC都产生炎性细胞因子IL-1A和TNFα，以及IL-15，其参与细胞毒性CD8 T淋巴细胞（CTL）的发育。因此，转导的DC系中的细胞因子和TLR表达与传统方法产生的DC相似。此外，转导的DC上调了促生存蛋白Bcl-xL，以及其他生长促进、信号传导和细胞周期进展途径，表明其永生化。为了增强理想靶表位的抗原呈递，研究小组用编码pTERT的融合构建载体转导了ihv-DC2细胞，该融合构建载体由人端粒酶逆转录酶（hTERT）的片段与IκBα的蛋白酶体靶序列相连。hTERT包含六个HLA-A2限制性CTL表位，并在DC内降解以促进表位呈递。将ihv-DC2-pTERT细胞与自体PBMC混合导致自体CD8 T细胞激活，从而产生大量的IFN-γ和TNF-α。然而，CD8 T细胞扩增是适度的。为了增强对hTERT的免疫反应，研究人员将两种HLA-DRB1分子引入ihv-DC2-pTERT细胞中。这种修饰的同种异体活性DC激活CD4 T细胞，从而增强CD8 CTL的增殖，使TERT骨肉瘤，黑色素瘤和肺癌细胞能够以HLA-A2限制的方式裂解。
03
ihv-DC的体外模型免疫
由于癌细胞在HLA分子的表达中通常是异质的，因此需要诱导HLA特异性CTL反应和HLA非依赖性自然杀伤（NK）细胞反应。为此，Wu等人设计了ihv-DC1细胞，高表达NK细胞活化相关MICA和4-1BBL，以及内源性表达的CD58，有效地激活了NK细胞。这些修饰的DC也与HLA-A2.1分子一起转导，并使其过表达抗原MAGEA3，该抗原存在于许多癌症类型中。将构建的DC（ihv-DC1.2-MAGEA3）与来自不同供体的HLA-A2匹配的幼稚PBMC孵育至少2周，导致了CTL和NK细胞的激活并刺激，引发的CTL能够以HLA-A2限制的方式裂解各种类型的MAGEA3癌细胞，而活化的NK细胞对HLA-A2癌细胞具有很高的细胞毒性。
04ihv-DC的体内癌症免疫
继续进行体内实验，研究人员向NSG小鼠注入A549-Luc / A2.1细胞以建立肺转移，然后用ihv-DC1.2-MAGEA3引发的细胞毒性淋巴细胞治疗小鼠，与对照组中发现的增大的肺部相比，治疗组小鼠的肺部外观和体重正常，在接受治疗的小鼠的肺部没有检测到癌细胞，在治疗小鼠的肺组织中均发现CTL和NK细胞，在脾脏和淋巴结中也检测到CTL，在肝脏中检测到较弱的CTL。
注：ihv-DC1.2-MAGEA3诱导的NSG小鼠细胞毒性淋巴细胞对转移性肺癌癌症的抑制作用。（A） 对照组和Tx组NSG小鼠的体重。（B） 对照组和Tx组NSG小鼠在终点的全肺重量。（C）对照组和Tx组NSG小鼠在终点的全肺图像。（D） 对照组和Tx组小鼠肺组织的萤光素酶活性。（E和F）用抗HA（血凝素）抗体进行IHC染色，以检测对照组（E）和Tx组（F）小鼠各器官中的HLA-A2.1-HA蛋白。
注：ihv-DC1.2-MAGEA3激活的CTL和NK细胞浸润肺组织。（A和B）针对对照组（A）和Tx组（B）中的小鼠的各种组织样品分析抗CD3 IHC。（C）Tx组中五只小鼠的肺组织的抗-CD3或抗NKp46 IHC染色。
综上所述，Wu等人开发了一种建立永生化和组成性激活的人原代血DC系的方法，并探索了对DCs的各种修饰以增强其免疫治疗潜力，具相关报道，此项技术国内已步入临床试验阶段。
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